PIPES缓冲液制备高效率感受态方法

发布时间: 2021-05-30

哌嗪二乙磺酸PIPES有多种缓冲液体系，其中缓冲溶液Transformation Buffer（也叫TB溶液）可用于制备高效率感受态的细胞。

感受态是指细胞（或细菌）能够从周围环境中摄取DNA分子，并且不易被细胞内的限制性核酸内切酶分解时所处的一种特殊生理状态。有些细菌是自然感受态，如枯草芽孢杆菌，有些是人工感受态，如大肠杆菌。经过特殊方法处理受体细胞，可改变细胞膜通透性，使其成为容许有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞。

感受态TB溶液原料——PIPES粉末

Transformation Buffer制备：

配制哌嗪二乙磺酸PIPES 3.0g 10mM、CaCl2·2H2O 2.2g 15mM、KCl 18.6g 250mM，加水 950ml，用5N KOH 调PH至6.7-6.8*低PH不溶，再加终浓度为55mM的MnCl2·4H2O 10.9g定溶到1升，过滤灭菌，4度保存。

感受态细菌细胞的转化采用氯化钙的方法。液氮或低温冰箱中取出的大肠杆菌，在LB平板上划线，37度过夜至长出单菌落。挑直径1-3mm 的菌落接种到250ml/3L锥形瓶或80ml/1L 锥形瓶的SOB培养基。在18度150-250RPM 培养19-50h。当OD600约0.4-0.8时停止培养，放在4度冰水中冷却10min，300RPM离心15min，回收菌体去掉上清后，用1/3体积的冰冷TB溶液悬浮，在冷10min再次离心回收菌体用1/12.5体积的TB悬浮，添加最终浓度为7%的DMSO，再冷却10分钟0.1-1ml 分装，直接在液氮或-80度保存。

悬浮大肠杆菌的TB溶液中，主要其作用成分包括缓冲液PIPES和使细胞转化成感受态的氯化钙。需要注意的是，该方法适用不含有质粒的大肠杆菌菌株，而不适合大质粒，冻存后转化效率有降低的可能。另外，不同细菌菌株的最适宜OD600也是是不同的，需要根据不同试验调整。

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